INC國(guó)際兒童腦瘤大咖、世界神經(jīng)外科聯(lián)合會(huì)(WFNS)執(zhí)行委員會(huì)&顧問(wèn)委員會(huì)成員之一的James T. Rutka教授發(fā)表研究《Transient receptor potential melastatin 7 signaling in U251 cell migration and invasion involves calcineurin》(U251細(xì)胞遷移和侵襲中瞬時(shí)受體電位褪黑素7信號(hào)通路涉及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶)，以下是研究簡(jiǎn)述。

　　01. 摘要

　　瞬時(shí)受體電位褪黑素7(TRPM7)是一種二價(jià)陽(yáng)離子通道，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。GBM是成人中最常見(jiàn)且最致命的原發(fā)性腦腫瘤。既往研究顯示，改變TRPM7的活性會(huì)影響GBM細(xì)胞的功能，包括細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖。因此，闡明GBM中TRPM7介導(dǎo)的信號(hào)通路可能會(huì)揭示新的治療靶點(diǎn)。鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是一種鈣依賴性磷酸酶，同樣影響GBM細(xì)胞的存活和遷移。然而，TRPM7與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶在GBM信號(hào)傳導(dǎo)中的作用或關(guān)系尚未被研究。在這項(xiàng)研究中，我們提供了證據(jù)，表明在GBM細(xì)胞系U251中，TRPM7與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶之間可能存在相互作用。此外，我們采用藥理學(xué)方法證明，TRPM7調(diào)節(jié)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的功能，這表明在U251細(xì)胞的遷移和侵襲中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶是TRPM7信號(hào)傳導(dǎo)的潛在下游靶點(diǎn)。

　　02. 研究結(jié)果

　　(1)帶有Flag標(biāo)簽的TRPM7從HEK293和U251細(xì)胞裂解液中免疫沉淀出鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A亞基。

　　圖 1：在HEK293和U251細(xì)胞中，F(xiàn)lag-TRPM7免疫沉淀鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A亞基。通過(guò)免疫印跡法分析了來(lái)自(A)HEK293細(xì)胞裂解液和(B)U251細(xì)胞裂解液的Flag-TRPM7相關(guān)蛋白復(fù)合物。在共免疫沉淀(co-IP)和輸入(HEK293或U251細(xì)胞總裂解液)泳道中均檢測(cè)到TRPM7(212 kDa)和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A(61 kDa)，而在陰性對(duì)照泳道(未使用抗Flag抗體進(jìn)行共免疫沉淀的結(jié)果)中均未出現(xiàn)?？s寫(xiě)：TRPM7：瞬時(shí)受體電位黑素瘤7.

　　(2)鈣調(diào)蛋白在TRPM7與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶的相互作用中并不發(fā)揮中介作用。

　　圖2：在U251細(xì)胞裂解液中，組氨酸標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白可沉淀鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A，但不沉淀TRPM7.將純化的6×組氨酸標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白加入U(xiǎn)251細(xì)胞總裂解液中。在缺乏Ca2+的情況下，蛋白復(fù)合物被沉淀并用西方印跡法分析。陽(yáng)性對(duì)照組包含U251細(xì)胞裂解液和組氨酸標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白。作為陰性對(duì)照，也進(jìn)行了不加組氨酸標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白的沉淀實(shí)驗(yàn)。在沉淀的洗脫樣品中檢測(cè)到鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A(61 kDa)和組氨酸標(biāo)記的鈣調(diào)蛋白(20 kDa)，而TRPM7通道蛋白(212 kDa)僅存在于上清液中?？s寫(xiě)：TRPM7：瞬時(shí)受體電位黑素瘤7.

　　(3)抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可增加TRPM7蛋白的表達(dá)。

　　圖3：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制增加TRPM7蛋白和mRNA水平。(A)用載體(DMSO;對(duì)照)或CsA(10、20、40或80 µM)處理U251細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行CCK-8實(shí)驗(yàn)(n = 10/組)。分析采用單因素方差分析(**p < 0.01)。(B–D)細(xì)胞在RNA或蛋白提取前24小時(shí)用載體(DMSO;對(duì)照)或10 µM CsA處理。(B)西方印跡帶的代表性圖像和(C)以GAPDH為對(duì)照的曝光強(qiáng)度，使用ImageJ處理，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(*p < 0.05;n = 8或9/組)。(D)使用qRT-PCR檢測(cè)TRPM7 mRNA水平，并以GAPDH為參考基因。用t檢驗(yàn)分析對(duì)照組和處理組之間的差異(***p < 0.001;n = 6/組)?？s寫(xiě)：TRPM7：瞬時(shí)受體電位黑素瘤7;CsA：環(huán)孢素A。

　　(4)使用TRPM7激活劑并不能逆轉(zhuǎn)鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制對(duì)U251細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

　　圖4：CsA和naltriben聯(lián)合治療對(duì)U251細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用與單獨(dú)使用CsA治療相似。細(xì)胞用DMSO載體、CsA和/或naltriben(分別為10和25 µM)處理。(A)傷口愈合實(shí)驗(yàn)。在劃痕后0和24小時(shí)拍攝圖像，并使用ImageJ勾勒傷口大小。(B)采用單因素方差分析和事后圖基檢驗(yàn)比較各組傷口閉合百分比(*p < 0.05;與25 µM naltriben組相比：#### p < 0.0001;與10 µM CsA組相比：ns，無(wú)顯著差異;n = 7/組)。比較10 µM CsA組與對(duì)照組時(shí)，發(fā)現(xiàn)有顯著的中度減少(p < 0.05)。(C)奧里斯遷移實(shí)驗(yàn)。在傷口形成后0、12、24和48小時(shí)拍攝圖像，并使用ImageJ勾勒傷口大小。(D)采用單因素方差分析和事后圖基檢驗(yàn)比較各組傷口閉合百分比(*p < 0.05;**p < 0.01;與25 µM naltriben組相比：#### p < 0.0001;與10 µM CsA組相比：ns，無(wú)顯著差異;n = 7/組)。(E)馬特里格爾侵襲實(shí)驗(yàn)。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ns，無(wú)顯著差異;**p < 0.01.與對(duì)照組相比;#### p < 0.0001.與25 µM naltriben組相比;n = 3/組)。比較10 µM CsA組與對(duì)照組時(shí)，發(fā)現(xiàn)有中度減少的趨勢(shì)(p = 0.131)?？s寫(xiě)：CsA：環(huán)孢素A;ANOVA：方差分析。

　　(5)環(huán)孢素A(CsA)誘導(dǎo)的PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路的變化不受納爾曲苯(naltriben)的影響。

　　圖5：CsA和naltriben聯(lián)合治療對(duì)AKT和ERK磷酸化水平的影響與單獨(dú)使用CsA治療相似。細(xì)胞在蛋白收集進(jìn)行西方印跡前24小時(shí)用載體、CsA和/或naltriben(分別為10或25 µM)處理。使用ImageJ分析光密度。(A)代表性圖像和(B、C)p-AKT和t-AKT水平的統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗(yàn)評(píng)估顯著差異(**p < 0.01.與對(duì)照組相比;#### p < 0.0001.與25 µM naltriben組相比;n = 7/組)。(D)代表性圖像和(E、F)p-ERK和t-ERK水平的統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和事后圖基檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(各組間無(wú)顯著差異;n = 4/組)。需要注意的是，盡管與對(duì)照組相比，10 µM CsA組和聯(lián)合治療組有降低的趨勢(shì)，但我們并未觀察到顯著性(p > 0.05)?？s寫(xiě)：CsA：環(huán)孢素A;ANOVA：方差分析。

　　圖6：使用 Biorender 創(chuàng)建的圖形摘要。

　　03. 結(jié)論

　　現(xiàn)有的研究結(jié)果表明，瞬時(shí)受體電位褪黑素7(TRPM7)通道與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A亞基蛋白之間存在相互作用，這種相互作用可能是直接的，也可能是間接的。異常的TRPM7活性可以通過(guò)多種途徑增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)細(xì)胞的功能，而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶可能是其潛在的下游靶點(diǎn)之一(圖6)。在本研究中，我們采用了一種GBM細(xì)胞系(即U251)來(lái)闡明這一機(jī)制。需要注意的是，目前在U251細(xì)胞系中獲得的研究結(jié)果可能并不能完全反映TRPM7在膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)特性。未來(lái)的研究應(yīng)考慮使用其他GBM細(xì)胞系以及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證TRPM7與鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶之間的相互作用。通過(guò)在TRPM7介導(dǎo)的信號(hào)通路中識(shí)別潛在的藥物靶點(diǎn)，我們的最終目標(biāo)是推動(dòng)新型化療藥物的研發(fā)，為GBM的治療提供新的手段。

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