INC國際兒童腦瘤大咖、世界神經(jīng)外科聯(lián)合會(WFNS)執(zhí)行委員會&顧問委員會成員之一的James T. Rutka教授發(fā)表研究《Characterization of a Clival Chordoma Xenograft Model Reveals Tumor Genomic Instability》(少突膠質(zhì)細胞病與局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良I型的磁共振成像、腦磁圖及手術結果比較)，以下是研究簡述。

　　01. 摘要

　　患者源性異種移植模型(PDX)較培養(yǎng)中的腫瘤細胞更能保留親代腫瘤的遺傳特征。既往報道的兩種斜坡脊索瘤異種移植模型均源自放療后復發(fā)的腫瘤。為研究未接受放療暴露的斜坡脊索瘤遺傳學特征，我們在原發(fā)性切除術中建立了患者源性異種移植模型。通過手術收集的斜坡脊索瘤組織進行顱骨外板移植，在非肥胖性糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)中成功建立腫瘤生長，并連續(xù)傳代七代。再生腫瘤顯示出典型的囊泡狀細胞結構，免疫組化染色對Brachyury、細胞角蛋白和S100蛋白呈陽性反應，且具有骨質(zhì)侵犯特征。

　　單核苷酸多態(tài)性分析顯示，與親代腫瘤相比，異種移植腫瘤中觀察到T基因(Brachyury)的拷貝擴數(shù)增及細胞周期依賴性激酶抑制因子2A(CDKN2A)的雜合性缺失。盡管腫瘤抑制基因脆性組氨酸三聯(lián)體(FHIT)存在雜合性缺失，但FHIT蛋白表達得以保留。連續(xù)三代傳代過程中觀察到拷貝數(shù)缺失和擴增的累積以及腫瘤生長速率的加快。

　　該患者源性異種移植模型成功復現(xiàn)了斜坡脊索瘤的表型特征。未來該模型可用于深入研究脊索瘤的生物學行為，并作為評估新型治療方法的實驗平臺。

　　02. 材料與方法

　　腫瘤采集與初始植入

　　經(jīng)患者知情同意后，依據(jù)圣邁克爾醫(yī)院倫理委員會批準的方案采集腫瘤組織用于研究?；颊邽橐幻?8歲男性，主訴頸部疼痛及舌肌無力持續(xù)1年。術前顱底磁共振成像(MRI)及計算機斷層掃描(CT)顯示，下斜坡中央?yún)^(qū)存在占位性病變，向下延伸至C2椎體水平，未發(fā)現(xiàn)轉移性病變。影像學檢查顯示病灶呈異質(zhì)性強化，T1加權像呈低信號，T2加權像呈高信號，并伴有骨質(zhì)侵蝕(圖1)。

　　在術中導航引導下，采用經(jīng)鼻-經(jīng)蝶內(nèi)鏡手術切除腫瘤。在確保獲取足夠組織用于病理診斷后，將數(shù)塊腫瘤組織包裹于無菌紗布中，置于部分注滿生理鹽水的標本容器內(nèi)以保持組織濕潤。會診病理學家通過免疫組化分析確認診斷為經(jīng)典型脊索瘤(未另作分類)。腫瘤組織顯示整合酶相互作用因子1(Integrase Interactor 1)及p53表達陽性。術后患者病情迅速進展。

　　圖1 原發(fā)性斜坡脊索瘤的影像學特征

　　A: 軸位T1加權磁共振成像(MRI)顯示斜坡中線區(qū)占位性病變(T)。

　　B: T1加權釓增強MRI顯示腫瘤(T)呈異質(zhì)強化性。

　　C: 軸位T2加權MRI顯示下斜坡區(qū)高信號微囊性硬膜外腫瘤(T)。

　　D: 軸位平掃計算機斷層掃描(CT)顯示斜坡骨質(zhì)侵蝕(箭頭)。

　　03. 討論

　　近年來，針對脊索瘤(一種對標準化療高度耐藥的腫瘤)新型治療藥物的研究模型的建立引起了廣泛關注。

　　本研究報道了一種未接受過放療的患者源性斜坡脊索瘤在非肥胖性糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)中的生長及連續(xù)傳代情況。這是文獻中報道的第三個患者源性斜坡脊索瘤模型，但卻是首個源自未放療腫瘤的模型。該模型的優(yōu)勢在于其保留了腫瘤形成所需的起始突變。小鼠中腫瘤的初始生長較為緩慢，耗時超過3個月。然而，隨著起始細胞數(shù)量的增加，腫瘤在植入后15天即可觸及。腫瘤的緩慢生長隨后進入快速擴張期，最終導致各代小鼠死亡，這一過程與人類臨床病程相似。異種移植瘤的細胞學特征與原發(fā)腫瘤一致，即由圓形核的囊泡狀細胞構成，周圍環(huán)繞結締組織基質(zhì)(圖5E)。異種移植瘤內(nèi)的結締組織源自宿主小鼠細胞。因此，囊泡狀細胞能夠引導支持性基質(zhì)的形成。這一發(fā)現(xiàn)意義重大，因為該模型可用于研究腫瘤微環(huán)境的變化以抑制腫瘤生長。異種移植瘤細胞侵入骨質(zhì)，與人類脊索瘤的表現(xiàn)一致。原發(fā)腫瘤的術前影像學檢查顯示斜坡呈內(nèi)生性(Ⅰ型)破壞(圖1)。近期研究顯示，與外生性(Ⅱ型)斜坡脊索瘤相比，具有這種生長模式的斜坡脊索瘤與細胞運動性和侵襲性蛋白的差異表達相關。本異種移植斜坡脊索瘤模型可用于進一步研究導致觀察到的腫瘤細胞學特征的細胞相互作用、腫瘤微環(huán)境中的信號傳導過程以及骨質(zhì)侵襲機制。在腫瘤原生環(huán)境中進行研究可避免二維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中可能出現(xiàn)的基質(zhì)蛋白表達和細胞行為改變。

　　該未放療的建立的腫瘤異種移植模型對于評估放療后的基因組和蛋白質(zhì)組變化以及研究放療增敏劑的效果也將是有用的。在遺傳水平上，初始異種移植瘤(PDX0)及其第三代(PDX3)與親代腫瘤相比顯示出拷貝數(shù)變化，表明該斜坡脊索瘤模型的基因組不穩(wěn)定性。隨著PDX代數(shù)的增加，腫瘤生長加快，PDX4的Ki67指數(shù)較親代腫瘤有所增加。在本研究報道的斜坡脊索瘤PDX模型和一個骶骨脊索瘤細胞系(MUG-Chor1)中，6號染色體涉及T基因位點的區(qū)域拷貝數(shù)擴增得以保留，這一發(fā)現(xiàn)尤為顯著，因為該區(qū)域在我們的模型中連續(xù)三代以及在MUG-Chor1細胞系的多次傳代中均得以保留。通過RNAscope分析發(fā)現(xiàn)，從PDX0到PDX3代，T基因拷貝數(shù)有增加的趨勢。這些觀察結果支持T基因表達在脊索瘤維持中的重要性。既往研究表明，Brachyury表達對于脊索瘤細胞系的維持至關重要。此外，T基因拷貝數(shù)的增加可能促進了異種移植模型后期代的增殖，因為拷貝數(shù)增加與磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的激活相關。

　　對本文所述的患者源性脊索瘤異種移植模型進行的單核苷酸多態(tài)性分析顯示，與脊索瘤細胞系和腫瘤的SNP數(shù)據(jù)觀察結果相似的拷貝數(shù)擴增和缺失模式。既往研究顯示，在一組脊柱和骶骨脊索瘤中，CDKN2A的雜合性缺失發(fā)生率為58%，純合性缺失為12%。在本模型中，CDKN2A表現(xiàn)為雜合性缺失，但作為廣泛9號染色體雜合性缺失的一部分。包括CDKN2A位點的9p缺失發(fā)生在18例中的4例(22%)斜坡脊索瘤中。同樣，F(xiàn)HIT的雜合性缺失作為染色體...

　　FHIT編碼一種在多種癌癥中丟失的腫瘤抑制蛋白。在67%的斜坡脊索瘤和98%的骶骨脊索瘤中，F(xiàn)HIT蛋白表達降低或缺失。在因吸煙暴露導致的肺部癌前病變中觀察到FHIT基因的單等位基因缺失。在缺乏一個FHIT基因等位基因的小鼠中，78%在給予單一劑量的致癌物N-亞硝基苯甲胺后發(fā)展為前胃腫瘤，且在21個月后平均每只小鼠自發(fā)形成0.94個腫瘤。因此，單次打擊事件(如單等位FHIT缺失)可能足以觸發(fā)脊索瘤的發(fā)生。盡管在已建立的異種移植模型中觀察到FHIT蛋白表達，但蛋白功能可能因FHIT基因轉錄本的改變而改變(在宮頸癌中報告了FHIT基因轉錄本的改變)。腫瘤細胞中FHIT的顯著表達表明該蛋白在這些細胞的細胞生物學中具有重要作用，類似于在腎集合管細胞中的表達。值得注意的是，不僅脊索細胞，而且形成中間中胚層并隨后形成腎集合管的胚胎細胞均顯示Brachyury表達。

　　本研究未探討FHIT等位基因mRNA轉錄本的改變;因此，該模型中是否存在功能性FHIT蛋白這一問題目前尚無答案。觀察到從親代到第三代腫瘤的大規(guī)模和小規(guī)?；蚪M改變，包括染色體不平衡以及全基因組拷貝數(shù)擴增和缺失的增加。本研究首次顯示，隨著異種移植腫瘤的多代生長，脊索瘤中存在染色體基因組不穩(wěn)定性。尚不確定拷貝數(shù)變化的累積是否是所有脊索瘤細胞的固有特征，還是由于選擇性偏差導致更可能適應非人類細胞外環(huán)境的腫瘤細胞(因DNA修復機制的缺失)。然而，至少一部分脊索瘤細胞顯示出拷貝數(shù)變化的累積，這可能解釋了該腫瘤對放療和化療的耐藥性。已知基因組不穩(wěn)定性使其他腫瘤(如黑色素瘤和結直腸癌)對化療產(chǎn)生耐藥性。

　　04. 研究結論

　　我們成功建立了一種源自未接受放療的斜坡脊索瘤的患者源性異種移植模型(PDX)，該模型可在免疫缺陷小鼠中連續(xù)傳代，并穩(wěn)定形成與脊索瘤細胞學及免疫組化特征一致的腫瘤病灶。隨著傳代次數(shù)的增加，腫瘤基因組拷貝數(shù)的擴增和缺失呈累積性變化，提示染色體不穩(wěn)定性可能在脊索瘤的進展及化療耐藥性中發(fā)揮重要的生物學作用。

　　圖2.蘇木精-伊紅染色顯示脊索瘤異種移植瘤(箭頭)侵入小鼠顱骨。比例尺為50毫米。

　　圖3 A: 異種移植瘤植入后各代小鼠的腫瘤生長曲線。圖中比較了第四代(PDX4)和第七代(PDX7)小鼠的腫瘤生長情況，顯示PDX7的腫瘤形成時間更早。

　　B: 原發(fā)腫瘤、PDX4及PDX7的組織學切片，顯示Ki67免疫組化染色結果。圖中量化了原發(fā)腫瘤、PDX4及PDX7的Ki67指數(shù)，結果顯示PDX7的Ki67指數(shù)顯著高于原發(fā)腫瘤(P < 0.01)。比例尺為50毫米。

　　圖4原發(fā)腫瘤及第三代異種移植瘤(PDX3)的組織學切片顯示免疫組化染色對廣譜細胞角蛋白(Pan-CK)和核Brachyury呈陽性反應，且上皮膜抗原(EMA)缺失。蘇木精-伊紅(H&E)染色顯示腫瘤細胞學特征，即囊泡狀細胞形成的團塊周圍環(huán)繞一層紡錘形細胞，這一特征在異種移植瘤中得以保留。比例尺為40毫米。

　　圖5A: 親代脊索瘤的組織學切片，經(jīng)抗人FHIT抗體免疫標記。B: 第三代異種移植瘤的組織學切片，經(jīng)抗人FHIT抗體免疫標記。囊泡狀腫瘤細胞(箭頭)顯示顯著的免疫標記，而相鄰的小鼠結締組織(箭頭)未見標記。C: U87人膠質(zhì)母細胞瘤異種移植模型(陰性對照)的組織學切片，經(jīng)抗人FHIT抗體免疫標記。D: 人腎組織(陽性對照)的組織學切片，經(jīng)抗人FHIT抗體免疫標記。E: 第八代異種移植瘤的組織學切片，經(jīng)抗人核抗體免疫標記，識別囊泡狀腫瘤細胞為人源性，而相關結締組織(箭頭)源自小鼠。F: 小鼠骨骼肌(陰性對照)的組織學切片，經(jīng)抗人核抗體免疫標記。比例尺為20毫米。

　　圖6 A: 親代腫瘤(O)、原始異種移植瘤(PDX0)及第三代異種移植瘤(PDX3)的染色體拷貝數(shù)缺失(藍色)和擴增(紅色)圖譜。B: 染色體圖顯示6號染色體某區(qū)段的拷貝數(shù)擴增，該區(qū)段包含T基因。C: 針對T基因的探針進行的RNAscope分析。每個斑點表示單個RNA分子。通過Definiens XD 2.6版的自定義算法對每核斑點數(shù)量進行計數(shù)。核和斑點經(jīng)分割和輪廓描繪。PDX3的T基因標記水平顯著高于PDX0(P < 0.001)，表明該基因的拷貝數(shù)擴增。比例尺為10毫米。Chr6.6號染色體。

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